吡非尼酮与槲皮素通过 S1P / SPHK 信号通路抗小鼠肺纤维化比较研究
2019.11.10关键词: 特发性肺纤维化; 吡非尼酮; 槲皮素; S1P / SphK1 信号通路; 纤维化相关蛋白
特发性肺纤维化( IPF) 是由慢性的上皮细胞损伤，纤维细胞异常活跃造成的，而吡非尼酮作为 IPF 治疗的新晋推荐药物，具有抗炎、抗氧化及抗纤维化的作 用，但吡非尼酮调节纤维增生的机制至今尚未完全清 楚，其生物学活性可能是多靶点的。槲皮素是一种黄 酮类化合物，存在于多种具有抗纤维化作用的草药中。我们的先期研究发现槲皮素通过抑制 SphK1 / S1P 信号在体内和体外均可改善肺纤维化［1］。有研究表明， S1P / SphK1 通过与多种细胞作用参与促纤维炎症及纤维化的过程，其中包括改变血管通透性、白细胞浸润、迁移、成纤维细胞和肌成纤维细胞的分化增殖［2－3］。本研究初步探讨吡非尼酮抗肺纤维化作用是否与调节S1P / SphK1 信号通路有关，并与槲皮素进行比较，为临床用药提供更多的理论支撑。
1.3小鼠肺间质纤维化模型病理学观察
行HE 染色和Masson 染色，分别于 100 倍和 400 倍光学显微镜下进行观察肺组织肺泡炎和肺纤维化程度。
1.4Real－time PCR 检测各组小鼠肺组织中鞘氨醇磷酸化酶 1( SphK1) mRNA 表达水平
步骤遵循试剂盒说明书，利用总 RNA 提取试剂盒提取样本总 RNA，将得到的 RNA 样本进行反转录，得到对应的 cDNA，PCR 反应体系包括: cDNA 模板 1 μL，上下游引物( 10 μM) 各 0． 5 μL，SYBR GREEN mastermix 10 μL，用 ddH2 O 补足至 20 μL，采用 Prime Premier 5．0 软件进行引物设计，实验中所用到的引物如下: 小鼠 Sphk1( forward 5' － ACGAGCAG GTGACTA- ATGAAGA－ 3'，reverse 5' － GTGCCCACTGTGAAACGAA－ 3') ，内 参 GAPDH ( forward 5' － GGACGCATTG- GTCGTCTGG － 3'，reverse 5' － TTTGCACTGGTACGTGTTGAT－3') 本实验利用韩国 BIONEER 公司生产的 Exi- cyclerTM 96 荧光定量仪进行荧光定量分析，每种样本每个基因进行 4 个复孔平行实验，实验数据的选取，舍去误差较大的数值，取剩余数值的平均值作为最终实验保留数据，结果数据采用方程 2 － △△ CT 计算目的基因的表达水平。
1.5Western－ blot 检测各组小鼠肺组织中 fibronectin ( FN) 、α－SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和 SphK1 蛋白表达水平
根据每个样本的质量及体积加入相应体积的 RI- PA 裂解液，裂解样本，然后继续置于冰上静置 5 min。低温冷冻离心机，10 000 r / min，4℃ ，离心 10 min，分离上清为所得的蛋白质抽提物。用考马斯亮蓝法测定蛋 白浓度，取总蛋白含量为 40 μg / 孔上样，进行 SDS － PAGE 约 2．5 h，电转移于 PVDF 膜上( 电压 80 V 转印1.5h) 上，用 5%( M / V) 脱脂奶粉稀释抗体，制成抗体工作液。一抗 4℃ 孵育过夜。实验中所孵育的一抗分别为: fibronectin antibody( 1: 300，BOSTER，BA1771，中国) α－ SMA antibody( 1: 500，BOSTER，BM4172，中国) Collagen I antibody ( 1: 500 ，Bioss，bs － 7158R，中国) Collagen III antibody( 1: 500 ，BOSTER，BM1625，中国) Sphk1 antibody( 1: 300，BOSTER，BA2865，中国) 次日 TBST 洗膜洗 4 次，每次 5 min，分别加入相应二抗 Fi- bronectin，α－SMA，Collagen I，Sphk1 二抗为羊抗兔 IgG－HRP( 1: 5000，碧云天，A0208，中国) Collagen III 二抗为羊抗小鼠 IgG－HRP( 1: 5000，碧云天，A0216，中国) 37℃ 孵育 45 min，TBST 洗膜洗 6 次，每次 5 min，后加入化学发光试剂，X 线胶片曝光。同时以内参 GAPDH进行对照，染色方法同上。将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统( Gel－Pro－Analyzer 软件) 分析目标条带的光密度值。
1.6ELISA 试剂盒检测各组小鼠血清和肺组织中1－磷酸鞘氨醇( S1P) 表达水平
根据组织重量和 PBS1: 9 匀浆。10 000 r / min，离心 10 min，上清为实验所需蛋白样品，血清 1 000 r / min离心 10 min，取上清即可检测。参照 ELISA 试剂盒说明书进行试验，以空白孔调零，酶标仪 450 nm 波长，依序测量各孔吸光度。每孔设 3 个平行孔，以标准品浓度的对数为纵坐标，OD 值为横坐标，做出标准曲线，然后计算含量。
1.7统计学方法
实验数据利用 SPSS 17．0 统计软件进行分析。组间数据比较采用单因素方差分析进行 t 检验以 P ＜0. 05 为差异有统计学意义。
2结果
2.1 HE 染色及Masson 染色观察各组小鼠肺部损伤情况
2.2小鼠肺组织中纤维化相关蛋白的表达
博来霉素显著增加小鼠肺组织中纤维化相关蛋白FN，α－SMA，Collagen I，Collagen III 的表达量，从分子水平上提示博来霉素诱导 IPF 小鼠模型建立成功，而吡非尼酮，槲皮素均可有效抑制肺纤维化相关蛋白FN，α－SMA，Collagen I 的表达水平从而起到抵抗肺纤
维化的作用( P＜0．01) ，如图 2 所示。这个结果与 HE、Masson 染色结果一致。两者比较无显著性差异。吡非尼酮与槲皮素在抑制 Collagen III 的表达方面均不明显，与模型组比较无显著差异。
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