强脊汤治疗强直性脊柱炎的疗效及其与免疫性炎症因子关系的实验研究.中医正骨,2002(11):3-4+63.
2021.10.04强脊汤治疗强直性脊柱炎的疗效及其与免疫性炎症因子关系的实验研究
提要强脊汤对强直性脊柱炎有确切的疗效‚为进一步探讨该方药对机体免疫功能的影响‚以TNF、IL-2为指标进行了实验观察。
实验Ⅰ选用30只SD大白鼠‚将Freunds氏完全佐剂注射于大鼠左后足掌皮下造成佐剂性关节炎模型‚随机分为强脊汤组、消炎痛组、对照组‚分别灌胃给药20天后下腔静脉取血‚采用放免法测定TNF。实验Ⅱ选用60只昆明种小白鼠‚采用腹腔注射AZP和Cy法造成免疫超常模型和免疫抑制模型‚随机分为强脊汤Ⅰ组、消炎痛Ⅰ组、对照Ⅰ组‚强脊汤Ⅱ组、消炎痛Ⅱ组、对照Ⅱ组‚分别灌药7天后挖眼取血‚采用放免法测定IL-2。结果显示‚该方药对佐剂性关节炎模型大鼠体内TNF水平具有明显的降低作用‚并可双向调节免疫异常小鼠体内的IL-2水平。表明该方药对改善免疫紊乱状态具有确切可靠的疗效。主题词强直性脊柱炎／中医药疗法强脊汤／治疗应用实验研究肿瘤坏死因子白介素-2动物大鼠／小鼠中图分类号：R681．5＋1；R285．5文献标识码：A文章编号：1001-6015（2002）11-0003-02强直性脊柱炎（ankylosingspondylitisAS）是以中轴关节慢性炎症为主的原因不明的全身性结缔组织疾病‚多见于青少年‚致残率较高‚给患者的生活和工作带来较大的痛苦‚目前国内外尚缺乏特效的药物治疗。山东中医药大学曹贻训教授采用自拟强脊汤治疗AS取得了较好的疗效〔1‚2〕。
为进一步探讨该方药治疗AS的疗效与TNF、IL-2的关系‚我们开展了本项课题研究。现将研究结果总结报告如下。1实验材料1．1实验动物①SD大鼠：雄性‚体重180±25g。②昆明种小鼠：雌雄各半‚4～5周龄‚体重18～22g。均由山东医科大学动物中心提供。1．2药品试剂①冻干卡介苗制剂（BCG）：卫生部兰州生物制品研究所。②环磷酰胺（Cyclophosphumlde‚Cy）：江苏恒瑞医药股份有限公司‚苏卫药准字（1998）第403501号。③硫唑嘌呤（AzathioprienAZP）：上海九福药业有限公司‚沪卫药准字（1997）第022069号。④消炎痛：山西省临汾制药厂‚晋卫药准字（1996）第034004号。⑤新鲜羊血、鸡红细胞悬液、豚鼠血清：山东中医药大学药理实验室提供。⑥强脊汤水煎剂（2g·ml－1）：山东中医药大学附属医院提供。1．3实验仪器①高速冷冻离心机（GL-20A）：湖南仪器仪表总厂离心机厂。②全自动放射免疫Υ计数器（FJ-2021）：西安国营二六二厂。③标准型净化工作台：吴江市净化设备总厂。2实验方法2．1对佐剂性关节炎模型大鼠血清TNF-α的影响2．1．1造模方法〔3〕将卡介苗100℃灭活40min‚用高压灭菌的液体石蜡配成10mg·ml－1的佛氏完全佐剂‚充分振荡混匀‚置4℃冰箱保存备用。选择体重180～220g范围内SD雄性大1广州中医药大学2001级博士研究生2山东中医药大学2001级博士研究生3山东中医药大学附属医院鼠30只‚将Freunds氏完全佐剂振荡混匀后注射于大鼠左后足掌皮下。2．1．2实验步骤〔3〕造模后随机分为强脊汤组、消炎痛组、对照组‚分别灌胃给强脊汤水煎剂2mg·200g－1‚消炎痛水溶液1．25·200g－1‚自来水2ml·200g－1‚每天灌胃给药1次‚于给药后第20天下腔静脉取血1ml‚室温下3000r离心15min‚分离血清‚取聚苯乙烯试管编号‚依照肿瘤坏死因子放免药盒说明书完成加样程序‚充分混合‚于4℃冰箱中静置24小时‚加入分离剂后充分混匀‚室温放置24小时‚4℃‚3500r离心25min‚吸弃上清液‚在自动Υ计数器上测其放射性‚计算结果。2．2对免疫异常模型小鼠的IL-2双向调节作用2．2．1造模方法〔4〕①免疫超常模型：AZP用0．01％NaHCO3稀释‚每只小鼠腹腔注射1．5mg·0．2ml－1；②免疫抑制模型：Cy用0．9％NS稀释‚每只小鼠腹腔注射3mg·0．2ml－1。2．2．2实验步骤取昆明种小鼠60只‚雌雄各半‚4～5周龄‚体重18～22g‚随机分为6组‚所有动物均注射2％CRBC悬液0．2ml。3天后（在此期间不做任何处理）‚对照Ⅰ组、强脊汤Ⅰ组、消炎痛Ⅰ组每只动物腹腔注射AZP0．2ml；对照Ⅱ组、强脊汤Ⅱ组、消炎痛Ⅱ组每只腹腔注射Cy0．2ml。然后‚分别灌药：强脊汤水煎剂0．2ml·10g－1‚消炎痛水溶液0．15mg·10g－1‚自来水0．2ml·10g－1‚7天后挖眼取血2ml‚室温下3000r离心15min‚分离血清‚取聚苯乙烯试管编号‚依照白介素-2放免药盒说明书逐步完成加液程序‚摇匀后于4℃冰箱中放置24小时‚加入分离剂后充分混匀‚室温放置20min‚4℃3500r离心25min‚吸弃上清液‚在自动Υ计数器上测定CPM数‚并计算血清浓度。2．3统计学方法采用SAS软件包计算‚各组参数作方差分析‚显著性检验。3实验结果3．1强脊汤对TNF水平的影响由表1可见‚中药组对血清中TNF水平具有明显的降低作用（P＜0．01）‚消炎痛组与对照组相比无显著性差异（P＞0．05）。中医正骨2002年11月第14卷第11期（总643）·3·
表1强脊汤对TNF水平的影响﹣x±s组别n浓度（ng·ml－1）对照组102．96±1．29强脊汤组101．05±0．31∗☆消炎痛组102．44±0．44☆☆注与对照组比较：∗P＜0．05；与消炎痛组比较：☆P＜0．01‚☆☆P＞0．053．2强脊汤对IL-2水平的影响由表2可见‚强脊汤对AZP所致的免疫超常模型具有降低IL-2的作用‚对Cy所致的免疫抑制模型具有升高IL-2的作用‚与对照组及消炎痛组比较有显著性差异（P＜0．01）。说明强脊汤能够针对不同的免疫状态发挥双向调节作用。表2强脊汤对IL-2水平的影响﹣x±s组别n浓度（ng·ml－1）对照组Ⅰ108．00±3．81消炎痛组Ⅰ107．88±3．96☆☆强脊汤组Ⅰ104．12±0．51∗☆对照组Ⅱ101．49±0．70消炎痛组Ⅱ101．64±0．86☆☆强脊汤组Ⅱ104．07±0．60∗☆注与对照组比较：∗P＜0．01；与消炎痛组比较：☆P＜0．01‚☆☆P＞0．054讨论4．1强直性脊柱炎的中医病机及本方组方依据中国传统医学无AS病名‚但就该病的临床表现而言‚属中医文献记载的“腰痛”、“肾痹”、“骨痹”等病的范畴。目前‚多数学者认为该病为先天禀赋不足‚后天失养‚导致肾虚督空‚筋脉失濡‚加之感受外邪‚筋骨经络闭阻而发病。山东中医药大学曹贻训教授多年来从事骨科疑难病症的中医药防治研究‚通过对大量AS患者的临床观察‚确立扶正祛邪、标本兼顾的治疗原则‚以滋补肝肾、益气养血作为治疗强直性脊柱炎的根本大法‚以祛风散寒、活血通络止痛作为治疗强直性脊柱炎的重要手段。制定了补益肝肾、益气养血、祛风散寒、活血通络止痛的方药。方中以独活、寄生、桂枝、清风藤、络石藤、千年健为君药‚以祛风散寒‚舒筋活络‚通阳行痹。全蝎、地龙为搜剔之品‚可祛经络之瘀‚使瘀闭开通‚经络通畅；元胡理气止痛；葛根不但为督脉引经之品‚而且配以白芍、甘草解肌止痛‚诸药共为臣药。又佐以狗脊、续断、补骨脂滋补肝肾；生黄芪、当归、白芍、川芎益气养血‚诸药合用‚可令气旺血行‚肝肾充实‚筋骨强健‚痹阻诸证自然迎刃而解。再使以甘草调和诸药。合方而具有补肝肾、益气血、祛风散寒、活血通络止痛之功‚该方攻补兼施‚寓补于通‚具有祛邪而不伤正的组方特点。4．2TNF、IL-2与AS的关系及中药对其影响近年来‚随着现代医学对该病的深入研究‚多数认为AS是在细菌感染、自身免疫、遗传、环境等多种因素的综合作用下‚通过分子模拟机制发生免疫应答所致。TNF是一类由巨噬细胞和激活的淋巴细胞等分泌的多肽类细胞因子‚具有广泛的生物活民生。巨参与炎症反应‚具有抗感染作用；同时也诱发其他细胞因子释放‚协同引起对机体的损坏作用。作用于血管内皮细胞（VEC）‚通过增加某些粘附分子的表达‚诱发血小板活化因子（PAF）及IL-1的释放而促进炎症细胞的粘附、游走、浸润及中性粒细胞的脱颗粒‚并以自分泌方式作用于单核巨噬细胞‚使其释放反应性氧属、PAF、白细胞三烯、前列腺素等炎症介质‚加强对病原体的吞噬与消化‚也因此扩大炎症反应‚引起组织损伤。TNF可激活破骨细胞并引起骨质吸收‚且其存在时骨胶原合成亦显著抑制‚并能诱导软骨吸收‚从而导致骨质破坏〔5～7〕。本研究证实‚强脊汤可明显降低大白鼠血清中的TNF水平‚说明强脊汤可以通过抑制患者体内的TNF来达到抑制骨修复和破坏的作用‚从而控制病情的进展‚防止致残‚这与本文观察的AS患者治疗后病情稳定相一致‚也是强脊汤治疗AS的机理之一。人体内存在着多种和多层次参与免疫调节的细胞群‚各细胞群相互制约‚相互协调‚维持着机体免疫应答的正常进行。近来年‚国内外均有报告提出AS患者存在多种抗体和细胞免疫改变‚提示该病具有自身免疫性特征〔8～10〕。AS患者存在着免疫紊乱状态‚临床上观察到AS患者多有迟发性超敏反应低下‚并有明显的B细胞系统活性增高‚往往表现为体液免疫亢进和细胞免疫低下。IL-2是近年来认识的最重要的淋巴因子之一‚由丝裂原、抗原或针对T细胞抗原受体的单克隆抗体激活的T细胞产生‚是一种分子量为15kD的糖蛋白。几乎所有激活的T细胞均可分泌IL-2‚其主要生物活性是促进T淋巴细胞和NK细胞的增殖‚促进B细胞分化增殖与功能表达‚促进抗体生成等〔11‚12〕。因此‚IL-2在细胞及体液免疫中均起重要的调节作用。本研究也证实强脊汤可双向调节IL-2水平。这说明强脊汤在细胞免疫中的确具有双向调节作用‚可减缓自身免疫的发生及发展‚从而减轻炎症及组织损伤‚使病情趋于稳定。这也许是本方发挥作用的关键所在。